REVERSE TRANSCRIPTASE PCR LÀ GÌ

  -  

Thuật ngữ PCR là viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đó là một phản bội ứng nhân phiên bản DNA dựa vào các chu kỳ luân hồi nhiệt độ. Bài viết này nhằm mục đích ra mắt các biết tin quan trọng đặc biệt về chuyên môn PCR cũng giống như những sự việc thường gặp Lúc sử dụng nghệ thuật này.

Bạn đang xem: Reverse transcriptase pcr là gì

 

KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?

 

Thuật ngữ PCR duy nhất phản bội ứng nhân bản DNA dựa vào những chu kỳ nhiệt. Phản ứng ra mắt trong một ống thử bé dại cất hỗn hợp phản ứng (Gọi là PCR mix). Trong PCR phối sẽ cất những thành phần:

1) Polymerase độ chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này còn có nhiệt độ vận động tối ưu sinh sống 72 oC.2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP.. là nguyên vật liệu để tổng phù hợp ra các phiên bản sao DNA.3) DNA đựng trình trường đoản cú phương châm (Template): Thông thường trong xét nghiệm thì đấy là DNA thu thừa nhận từ chủng loại buộc phải xét nghiệm.4) Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng chừng 20 nucleotide và bắt cặp bổ sung cập nhật đặc hiệu cho 2 đầu trình từ phương châm đề nghị nhân bản.5) Cation Mg2+ (MgCl2): đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase vận động tác dụng.6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Cung cung cấp môi trường tiện lợi mang đến làm phản ứng nhân phiên bản ra mắt.

 

Ống nghiệm cất PCR phối sẽ tiến hành đặt vào vào buồng ủ của máy luân sức nóng (Thermo cycler), sinh hoạt cả nước thì hay Điện thoại tư vấn luôn là sản phẩm PCR. Nhiệt độ bên phía trong phòng ủ của dòng sản phẩm PCR đã thay đổi theo chu kỳ, nhờ đó mà quy trình nhân phiên bản DNA được ra mắt (xem video).

 

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR

 

Một chu kỳ luân hồi sức nóng của PCR đang có 3 tiến trình nhiệt độ (Hình 1):

1 - Giai đoạn phát triển thành tính: Nhiệt độ sẽ được gửi lên 94 oC, các liên kết hydro có khả năng sẽ bị phá vỡ lẽ khiến DNA bị biến chuyển tính vươn lên là dạng mạch đối chọi.

Xem thêm: Ethtrade Là Gì ? Có Lừa Đảo Scam? Nên Đầu Tư Vào Ethtrade Không?

2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi vẫn bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự kim chỉ nam.3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được gửi lên 72 oC, Taq polymerase đang sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3" của mồi với tạo nên mạch bổ sung.
*
Hình 1. Chu trình nhiệt của một quá trình PCR

bởi vậy, cứ sang 1 chu kỳ nhiệt độ, số mạch DNA sẽ tiến hành nhân song. Nếu chu kỳ luân hồi sức nóng tái diễn thường xuyên 30 - 40 lần thì số phiên bản sao vẫn là 230 ~ 240 bạn dạng sao. Số lượng bạn dạng sao DNA lớn lao này Khi được đính thêm những phân tử phát dấu hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) hoàn toàn có thể bắt gặp bởi đôi mắt hay bên trên gel năng lượng điện di bên dưới ánh sáng của đèn UV (Hình 2).


1527453158292/Agarose-gel-electrophoresis-analysis-stained-with-ethidium-bromide-of-PCR-products.png" alt="*">
Hình 2. Ảnh chụp thành phầm PCR (giếng 1~7) bên dưới ánh sáng của đèn UVtrên gel agarose nhuộm bằng Ethidium Bromide

 

VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR

 

Nguim lý của PCR là khuếch tán DNA, bởi vì vậy những chống thí nghiệm sử dụng PCR liên tục ko nhanh chóng thì muộn cũng trở thành bị nhiễm sản phẩm PCR lên toàn bộ các vật dụng, khí cụ, Hóa chất. Người làm thí điểm đã phân biệt được thảm thảm kịch này lúc cục bộ những lần chạy PCR hầu hết ra dương tính, kể cả lúc sử dụng mẫu là nước cất. lúc điều này xảy ra thì chỉ tất cả giải pháp bỏ toàn cục hóa chất, khử lây nhiễm cục bộ chống thử nghiệm .... Dù vậy vấn đề này vẫn đã tái diễn sau một khoảng thời gian sử dụng PCR.


*
Hình 3. Sơ đồ vật cách xử lý thành phầm PCR ngoại truyền nhiễm bằng UNG

Nhiễm thành phầm PCR từng là thách thức so với những phòng nghiên cứu sinc học tập phân tử. Tuy nhiên, hiện giờ những nhà kỹ thuật sẽ có thể giải quyết sự việc này một bí quyết tương đối bổ ích (Hình 3), đó là trong yếu tố dNTP tất cả bổ sung cập nhật thêm một không nhiều dUTPhường. Các thành phầm PCR tạo ra đang luôn luôn tồn tại một số địa chỉ là U thay vì T, những địa chỉ U này đã có thể cách xử lý phân diệt bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu dấn từ mẫu thật (template) sẽ không chứa U, bởi vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước lúc PCR sẽ giúp đỡ phân giảm toàn thể các DNA ngoại lan truyền mà không ảnh hưởng mang lại template.

 

CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP TRONG XÉT NGHIỆM

 

1) PCR đối chọi mồi (Simplex PCR): Đây là vẻ bên ngoài PCR cổ điển độc nhất, sử dụng 1 cặp mồi sệt hiệu nhằm khuếch đại 1 đoạn trình tự kim chỉ nam tuyệt nhất.

2) PCR nhiều mồi (Multiplex PCR): Đây là vẻ bên ngoài PCR thực hiện các cặp mồi khác nhau nhằm khuếch tán những trình từ bỏ kim chỉ nam không giống nhau trong cùng 1 set bội phản ứng. Để xây dựng được phản bội ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi thực hiện phải có thuộc ánh sáng bắt cặp và các cặp mồi này cũng ko được bắt cặp cùng nhau xuất xắc bắt cặp chéo cho nhau. Ngoài ra, cũng đề nghị bảo đảm độ nhạy bén Multiplex PCR tương đương với Simplex PCR, điều này rất cạnh tranh xẩy ra yêu cầu thường thì multiplex PCR được sử dụng sinh hoạt những tế bào nuôi ghép vị hôm nay con số trình từ bỏ đích đủ phệ sẽ không đòi hỏi quá hà khắc về độ nhạy bén.

Xem thêm: Đọc Truyện Vợ Ơi Anh Biết Lỗi Rồi (Full), Tuyển Tập Truyện Hay


*
Hình 4. Sơ đồ một quy trình Nested PCR

3) PCR tổ (Nested PCR): Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi bên phía ngoài (outer primer) với cặp mồi phía bên trong (nested primer). Cặp mồi bên phía ngoài vẫn tham mê gia PCR lần 1 trước để làm tăng con số DNA cất trình trường đoản cú đích, kế đến là cặp mồi bên trong vẫn ttê mê gia PCR lần 2 nhằm phát hiện trình từ đích (Hình 4). Kỹ thuật này sử dụng Khi cặp mồi sệt hiệu mang đến trình từ đích (nested primer) có độ nhạy kém nhẹm.

4) RT-PCR: Là các bước thực hiện khi trình tự đích là RNA, từ bây giờ yêu cầu một bước thực hiện enzyme reverse transcriptase để đưa RNA thành cDNA trước lúc PCR, giai đoạn này gọi là quy trình RT. Kỹ thuật RT-PCR có 2 một số loại (Hình 5):